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凉州澳门新葡萄京997755技术中异养反硝化硫细菌分析

来源: 发布时间:2019-06-21 789 次浏览


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  多种工业废水及市政污水都同时含有碳、氮和硫系化合物.含氮化合物具有毒性和臭味,而且能够引起水体的富营养化.基于目前的生物处理技术,铵盐通常在好氧条件下被氧化为硝酸盐,然后硝酸盐在厌氧条件下通过反硝化作用被还原成氮气.自然界多种异养微生物(Micro-Organism)都能够利用各种有机物作为碳源和能源进行反硝化作用.它们具有丰富的生物多样性,通常属于变形菌门中不同的属,例如:Rhodofera
  X、Dechloromonas和Sulfuritalea.
  硫化物具有强烈的毒性和臭味,它的超标排放是目前面临的严峻的环境问题之一.它能够和细胞色素中的金属离子进行反应,进而抑制细胞的呼吸作用.此外,它还具有腐蚀性并产生很高的化学需氧量.硫化物通常在产甲烷的过程中伴随产生,它也产生于多种工业加工过程,例如:石油化工(petrochemical industry)、造纸、制革等.许多物理、化学和电化学方法已经用来处理气体和水中的硫化物,例如:沉淀法、气提、离子交换、电催化氧化(oxidation)、有机溶剂和化学氧化.其中,利用无色硫细菌的生物处理技术具有低成本、低能耗和产物无害等优势(说明:能压倒对方的有利形势).因此,它是一种国际上日益关注的热门技术.Thiobacillus denitrificans被发现能够利用无机硫化合物作为能量来源,无机碳化合物作为碳源进行生长.左剑恶等在升流式生物膜反应器中,利用无色硫细菌处理废水中的硫化物,去除率为90%,单质硫转化率为.这类能够利用无机硫化合物的自养反硝化细菌具有较高的研究价值,因为它在反硝化过程中不需要再额外添加有机碳源并节约经济成本.相关技术目前已经得到广泛的应用,例如:市政污水、地表水和垃圾渗滤液的处理.
  近年来,多单元联合生物技术快速发展并应用于处理含有碳、氮和硫系化合物的废水.此技术的过程原理为:厌氧发酵阶段硫酸盐还原所产生的硫化物及少量剩余COD在反硝化单元被来自硝化单元的硝酸盐氧化去除.在香港特别行政区,应用此技术已经成功建立了示范工程,主要进行沿海地区高硫酸盐生活污水的脱氮处理.脱氮单元中的活性污泥通常含有自养和异养反硝化细菌,其中有些物种能够利用含硫化合物还原硝化单元所产生的硝酸盐.除能以含硫化合物作为能源的自养反硝化细菌以外,一些异养细菌也被发现具有这样的功能.它们能够利用硫化物和硝酸盐进行呼吸作用,并产生单质硫和氮气作为反应产物.这种生物基单质硫具有亲水的特性,能够作为生产肥料和杀虫剂的原料,具有较高经济价值.
  本研究分离1株能够利用硝酸盐作为电子受体,乙酸盐和硫化物作为电子供体进行生长代谢的细菌.在硫化物氧化过程中,单质硫为主要的反应产物.已有的研究结果显示Thauera属的物种是澳门新葡萄京997755系统中最活跃的反硝化细菌,但是其硫氧化的生理特性极少有研究报道.本研究揭示菌株HDD1在生态学以及澳门新葡萄京997755技术应用中的重要意义.
  1 材料与方法1.1 菌株分离与培养条件
  活性污泥来源于实验室运行的澳门新葡萄京997755生物反应器.分离培养基包括以下物质:Na2S?9H2O,1.5;CH3COONa,0.387 5;KNO3,0.757 5;NH4Cl,1.0;KH2PO4,1.8;Na2HPO4?12H2O,3.0;MgSO4?7H2O,0.1;Agar,1.5.培养基灭菌后加入过滤灭菌的微量元素(trace element)液.采用亨盖特厌氧培养技术结合稀释灭绝法进行菌株的分离和纯化.活性污泥经过梯度稀释以后,接种到含有固体培养基的厌氧管中.在30℃条件下静置培养7 d后,单克隆被接种到液体培养基中进行培养.液体培养基经过煮沸和充入氩气达到厌氧条件,加入L-半胱氨酸和1 mL浓度为0.2%的刃天青作为除氧剂和指示剂.通过(tōng guò)在固-液分离培养基中反复转接得到细菌培养物.通过显微镜观察和16S rRNA基因测序技术检测其是否为纯培养.
  1.2 菌株鉴定
  采用Bacterial DNA Mini Kit 提取特殊结构:荚膜、鞭毛、菌毛基因组DNA.提取的基因组DNA经分光光度计定量后作为聚合酶链式反应的模板.采用细菌16S rRNA基因通用引物F27和R1492进行扩增反应.反应体系包括Q5 Hot Start High-Fidelity 2X Master Mix ,浓度为20 μmol?L-1的上下游引物,20 ng DNA模板和蒸馏水.采用GeneAmp PCR system 进行扩增反应,具体步骤设置如下:94℃起始变性3 min,94℃变性30 s,55℃退火30 s,72℃延伸1 min,30个循环.扩增产物经测序后,用BLAST-N程序和原核生物数据库进行比对分析.利用MEGA 5.0App包,采用邻位相连算法构建系统(system)进化树.进化树的拓扑结构经过1 000次引导重复取样检验.
  1.3 生理学和化学分析
  细菌经离心收集后,用磷酸盐缓冲液清洗3次,用2.5%戊二醛固定30min.用30%、50%、70%、90%、的乙醇(chún)脱水后,以饱和叔丁醇做介质进行真空干燥.利用扫描电子显微镜观察细胞形态.利用生化试剂条检测菌株的生理特征.细胞经过标准革兰氏染色后,用氢氧化钾(Potassium)消散法复检[25].菌体蛋白浓度测定采用Bradford Protein Assay Kit 的标准方法.CH3COO-、NO3-、NO2-、SO42-和S2O32-的浓度由离子色谱测定.S2-的测定采用标准亚甲基蓝分光光度法.利用能量散射谱仪测定单质硫及其含量.菌株的16S rRNA基因序列的GenBank登录号为KX242545.
  2 结果与分析2.1 菌株的分离与鉴定
  经过5轮固-液分离培养基转接,得到菌株HDD1.在显微镜视野下,细菌的形态呈统一的杆状;16S rRNA基因测序结果中不存在噪声信号,这表明菌株HDD1为纯培养.提交长度为1 397bp的16S rRNA基因序列到数据库进行比对分析,结果显示HDD1与Thauera aminoaromatica S2的相似度更高,达到98.7%.进化树结果显示HDD1在Thauera属中形成一个单源的进化枝,并与Thauera humireducens和Thauera terpenica形成一个进化群.用更大似然算法对系统进化树验证,得到相同结果.这些结果表明菌株HDD1可能是Thauera属的一个新种,但是还需多相分类结果进行验证.
图 1 邻位相连法构建16S rRNA基因系统进化树
  2.2 菌株的生理特性
  菌(fungus)株HDD1革兰氏染色呈阴性,细胞呈杆状.反硝化作用、吲哚反应和有机酸同化作用呈阳性;糖类水解酸化反应呈阴性.通常Thauera属的各个种是一类兼性厌氧,专性进行呼吸作用的细菌.它们能够利用氧气、氮氧化物作为电子受体,在好氧呼吸和反硝化作用之间转化代谢状态.有些种在厌氧条件下可以还原硒酸盐.很多种能够利用有机酸、氨基酸、芳香和脂肪(fat)类化合物进行生长.它们通常在澳门新葡萄京997755厂、江河、池塘沉积(sedimentation)物等被污染的地区被发现.菌株HDD1的生理特征结果和伯杰氏系统微生物学手册中Thauera属的描述相同.
图 2 菌株HDD1扫描电子显微镜图像

  表 1 菌株HDD1的生理学特性
  2.3 菌株的代谢特性
  菌株HDD1在厌氧条件下利用硝酸盐作为电子受体氧化乙酸盐和硫化物.在15 h之内,CH3COO-基本被完全代谢,其浓度由300 mg?L-1下降到20 mg?L-1,菌体蛋白浓度由1.5 μg?mL-1上升到11 μg?mL-1[图 3],生物量有所增加;NO3-浓度由487 mg?L-1下降到38 mg?L-1,NO2-在第15~20 h之间有短暂的积累,更高浓度为67.7 mg?L-1 [图 3];浓度为200 mg?L-1的S2-被完全代谢,S2O32-和SO42-的浓度略有上升[图 3].S2O32-和SO42-的背景值可能是由于在灭菌过程中发生轻微的氧化导致的.在0~5 h,CH3COO-浓度快速地由300 mg?L-1下降到128 mg?L-1,菌体蛋白浓度由1.5 μg?mL-1上升到5.7 μg?mL-1.在代谢反应初期,活化细菌直接进入对数生长期,生物量快速增加,CH3COO-浓度相应地快速下降.在此阶段,NO3-作为电子受体并没有相应地大幅减少.这是由于在对数生长期,大部分CH3COO-通过同化作用直接合成细胞物质,只有少部分通过与NO3-耦合进行呼吸作用.进入稳定(说明:稳固安定;没有变动)期和衰亡期后,细菌同化作用速率减小,需要产生大量能量维持细胞的生命活动.CH3COO-和S2-作为电子供体耦合NO3-进行呼吸作用,大部分NO3-被代谢消耗.为了限制S2-过度氧化成S2O32-和SO42-,增加单质硫的产量,电子受体NO3-浓度的初始设置较低.它也是工艺实际运行过程中一个重要的参数,根据进水COD含量和活性污泥状态而进行调整.随着硫化物被逐渐氧化,所形成的单质硫逐渐聚集成为直径不同的颗粒[图 4].这些颗粒主要是由
  C、
  O、S和P等元素组成.其中S元素占总含量的20%;由于样品中存在菌体等有机物,C元素占总量的68.6%;由于培养基中存在磷酸盐等物质,O元素和P元素分别占总含量的9.2%和2.1%[图 4].由于S2O32-和SO42-含量很低,根据化学反应元素平衡原理,硫化物氧化的主要产物为单质硫.硫酸盐被还原成硫化物,硫化物再被氧化,是硫元素生物地球化(退火工艺)学循环中重要的过程.这个过程涉及到多种复杂的反应、硫细菌和酶.无色硫细菌分为4个系统进化世系,3个属于细菌域,1个属于古细菌域.多数的无色硫细菌属于Proteobacteria门的Gammaproteobacteria纲.根据碳源和能量代谢方式,无色硫细菌可以分为不同的生理类型,包括:专性化能无机营养型、兼性化能无机营养型、化能无机异养型和化能有机异养型.化能无机异养型是指能够利用还原性含硫化合物作为能量来源,但是不能固定二氧化碳的细菌.根据生理学特性,菌株HDD1不能利用光能,且只能利用乙酸盐等有机物作为碳源,所以它属于化能异养型微生物.在氧化硫化物过程中其是否获得能量还需进一步验证.原位检测技术结果显示Thauera属在澳门新葡萄京997755系统中是一类活跃的反硝化细菌,但是很少有研究报道它们的硫氧化功能.微生物群落分析表明Thauera属在反应器的生态系统中具有很高的丰度,但是由于缺乏菌株的纯培养,深入的生理学特征研究很难开展.在生理学研究中,菌株HDD1可以作为研究Thauera属硫氧化功能的模式种为进一步的研究提供基础;在生态学研究中,它的相关功能基因可以作为分子标记,为搜索复杂群落中的功能微生物提供技术支撑.目前,造纸厂、煤气厂和制药厂等工业废水都含有大量的硫化物.生物法短程氧化硫化物并回收单质硫作为资源具备很多优势.首先,它是化学和化肥工业的原料.其次,和物理化学法相比,生物法更加节约能源和成本.分离并研究功能菌株的生理学特性是这项生物技术应用的重要保障.在这项技术中,菌株HDD1和其他常见的硫氧化细菌,例如:Thiobacillus denitrificans和Paracoccus denitrificans起到关键作用并有待更深入地研究.具体参见污水宝商城资料或
图 3 菌株HDD1的碳氮硫(化学符号:S)化合物代谢
扫描电子显微镜图像;能量色散谱分析图 4 菌株HDD1代谢产物分析
  3 结论
  在本研究(research)中,从反应器活性污泥中分离纯化出1株特殊结构:荚膜、鞭毛、菌毛HDD1.基于16S rRNA基因的系统进化分析显示,它与Thauera属的物种具有亲缘关系并形成一个单源的进化枝.生理特征实验结果验证表明菌株HDD1是Thauera属的一个种.菌株HDD1能够利用硝酸盐作为电子受体同步氧化硫(化学符号:S)化物和乙酸盐.在15 h之内,浓度为300 mg?L-1的CH3COO-、200 mg?L-1的S2-和487 mg?L-1的NO3-被完全代谢去除.根据其特殊的生理特征,菌株HDD1可以同时应用于处理含有碳(C)、氮、硫系化合物的工业废水及硫元素的资源化回收.
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